نقش كشت بافت در توسعه كشاورزي
كشت پينــه :
پينه زايي يك مرحله‌ي بسيار مهمي از كشت بافت را تشكيل مي‌دهد و توليد پينه‌هاي رويان زا كه داراي قابليت باززايي گياهي باشند همواره با محدوديت هايي مواجه بوده‌است. از‌اين گذشته در مطالعات پينه‌زايي دو عامل مهم زادمون و محيط ( غذا، نور و حرارت) بيش از همه مورد توجه قرارمي‌گيرد. زادمون‌هاي يك گونه يا زيرگونه پاسخ‌هاي متفاوتي نسبت به كشت نشان مي‌دهند. براي توليد پينه از كشت قطعات يك بافت نامتمايز يا كاملاً تمايز يافته و تبديل آن به يك توده ياختهاي تمايز نيافته با ساختاري بي‌سازمان در محيط هاي غذايي مصنوعي نيمه جامدي كه محتوي همه‌ي مواد غذايي پرمصرف، كم مصرف و ساكارز به اضافه‌ي تركيبات تنظيم كننده رشد به ويژه 2.4-D ، IAA ، NAA كينيتين و يك ژل نيمه جامد كننده باشد، استفاده مي‌شود. قسمت‌هايي از گياه كه مي‌تواند كشت شود شامل قطعات ساقه، ريشه. ميان برگ(مزوفيل)، لپه، نوك شاخه، بافت گل، كامبيوم آوندي، فلس‌هاي پيازي، درون دانه، محور رويان، اشعه‌مركزي، پارانشيم آوندي، سپرچه، محور زيرلپه، بساك، ريزهاگ و تخمك يا تخمدان مي باشد. اگرچه اندازه، شكل، منابع گياهي يا زادمون گياه و شيوه‌ي كشت در القاي تشكيل پينه تأثير بسزايي دارد اما هر نوع قطعه‌ي زير كشتي در شرايط محيط غذايي با تركيبات ويژه اي و دورة نوري خاصي به كشت پاسخ مي‌دهد. دانشمندان سي سال پس از شناسايي تركيب 2 ,4-D به خواص هورموني آن پي بردند و از آن در تمايز زدايي و توليد پينه استفاده كردند. در حال حاضر استفاده از اين هورمون در پينه زايي به طور وسيعي رواج يافته است. در اغلب گياهان و قطعات زيركشت، القاي پينه در 25 درجه سانتي‌گراد و در تاريكي انجام مي‌شود. پينه زايي از نشانويژگي‌هاي وراثتي محسوب مي‌گردد. علاوه بر اين عوامل تنكار شناختي ،منابع گياهي ، محيطي و تيمارسرمايي پيش از كشت به ويژه در كشت‌هاي مربوط به بساك و ريزهاگ و تخمك اهميت زيادي دارد.
كشت باززايي :
ياخته‌هاي پينه به منظور شاخه زايي و توليد گياه كامل به محيط‌هاي غذايي ديگري كه از نظر تركيبات به ويژه ميزان و نوع هورمون‌ها با محيط‌هاي غذايي پينه‌زايي متفاوتند، در شرايط گندزدايي شده انتقال مي‌يابند. با تغيير نسبت تنظيم كنندگان رشدي مي‌توان براي هر منبع گياهي، محيط غذايي باززايي مناسبي كه بيشترين بازدهي كشت را داشته باشد، تهيه كرد. در تمايزيابي پينه‌ها و به وجود آمدن اندام‌هاي نو پديد براي هر زاد موني دوره‌ي نوري و درجه حرارت معيني پيشنهاد شده است. همه‌ي پينه‌ها براي تبديل شدن به گياه كامل مناسب نيستند و فقط پينه‌هاي رويان‌زا كه اغلب دانه‌اي شكل، مدور، خشك و زرد كمرنگ هستند، بهتر پاسخ مي‌دهند. پينه‌هاي رويان‌زا پس از عمل تمايزيابي ،اندام‌هاي اوليه‌اي را به وجود مي‌آورند كه سپس به شاخه‌ها، ريشه‌ها، گل‌ها، جوانه‌ها و رويان‌ها تبديل مي‌گردند. در غلات محدوديت‌هايي از نظر باززايي گياهان زال مشاهده مي‌شود كه گاهي 90 تا 95 درصد توليد گياه را دربر دارد و براي جلوگيري از اين پديده نامناسب، تحقيقاتي در حال انجام است. باززايي پينه‌از مسائل بسيار پيچيده كشت بافت بوده كه در تعداد زيادي از گياهان، بدون حل باقي مانده است. متأسفانه تعداد زيادي از پينه هاي گونه ها و همجوشي بين گونه‌اي گياهان به باززايي پاسخ نمي دهند.
كشت بساك و ريزهاگ :
فنون كشت بساك و ريزهاگ به عنوان يك ابزار اصلاحي كارآمد و صرفه‌جويانه اي در توليد خط‌هاي جور تخم (هوموزيگوت) گياهي در مدت زمان كوتاه در به‌نژادي مورد استفاده قرار مي‌گيرد. گرده‌ي نارس يا ريزهاگ موجود در بساك در كشت‌هاي يك مرحله‌اي مستقيماً توليدگياه را مي‌نمايد و در حالت دو مرحله‌اي ابتدا پينه را توليد مي‌كند و سپس در شرايط غذايي ديگري با نسبت هورموني متفاوتي به گياه باززايي مي شود. ريزهاگ‌هاي داخل بساك تك لادند و نيمي از كروموزوم‌هاي بدني را در اختياردارند. هنگامي كه در فرايند كشت بساك به ياخته‌هاي پينه و سپس به گياه كامل تبديل مي‌گردند، ياخته‌هاي بدني آن‌ها، تماماً تك لاد و در نتيجه گياه تك لاد خواهد بود و از آن جا كه اين گياهان نمي‌توانند تقسيم ميوز را انجام دهند، از طريق بذر قابل تكثير نيستند (در مواردي كه پينه‌ها از ديواره بساك به وجود آمده باشند و يا به طورخود به خودي دولاد شده باشند و توليد بذر نمايند، بارورند). بنابراين، اين گياهان بايستي تحت اثر ماده شيميايي كولشي سين به گياهان دولاد تبديل گردند كه در آن كروموزوم‌ها به صورت جفت‌هاي مشابه وجود خواهند داشت و تك لادهاي دو برابر يا دولادهاي نرزاد (گياهان گرده‌اي) جور تخم و خالصند و در خط‌هاي زادگيري (breeding) به منظور بروز صفات زاد شناختي مغلوب ساده يا جهش يافته مورد استفاده قرار مي‌گيرند. برتري اين روش در مقايسه با دورگ‌گيري سنتي عبارت است از :
1- كاهش مدت زمان لازم به‌نژادي با تثبيت جور تخمي
2- افزايش بازدهي انتخاب به دليل احتمال بروز سريع ژن‌هاي مغلوب و پايداري ژن‌هاي نوتركيب بيشتر
3- تغيير پذيري وسيع زاد شناختي از راه توليد گوناگوني هاي گامتوكلني
4- حل مشكل عقيمي در تلاقي‌هاي دور.
تاكنون كشت بساك بيش از دويست گونه گياهي شامل غلات (جو، ذرت، چاودار، تري‌تيكال، گندم و غيره)، درختان ميوه (سيب ،گلابي، گيلاس،مركبات وبه)، درختان جنگلي (صنوبر و اوكاليپتوس)، سبزيجات (كلم، هويج، خيار، ترب، بادمجان)، گياهان زراعي (چغندر و توتون) وگياهان دارويي نيز به كشت بساك پاسخ داده‌اند. تاتوره اولين گياهي بود كه كشت بساك آن انجام شد. بازدهي كشت بساك به طور وسيعي به زادمون و ساختار زادشناختي گياه مادري و محيط كشت و شرايط نوري و درجه حرارت اتاق بستگي دارد. در كشت بساك غلات مدت زمان و درجه حرارت دوره سرما دهي و غلظت هورموني محيط غذايي كشت در ميزان توليد گياهان سبز تأثير مي‌گذارد. از مطالعه باززايي پينه‌هاي حاصل از نسل اول دورگ‌ها مي‌توان چنين استنباط كرد كه قابليت باززايي يك نشانويژگي وراثتي است و توسط ژن‌هايي هدايت مي‌شود. از اين گذشته در پينه‌هايي كه به منظور انتقال ژن با ذرات طلاي آغشته به DNA خارجي بمباران مي‌شوند و پينه‌هايي كه از پيش‌دش‌هاي امتزاج يافته حاصل مي‌گردند، باززايي به سختي انجام مي‌شود. پينه‌زايي و باززايي از مباحث اصلي پيشرفت و ترقي اين علم محسوب مي‌گردد كه فايق آمدن بر پيچيدگي‌ها و موانع آن‌ها پشتوانه قدرتمندي را در عرصه‌هاي كشاورزي نوين فراهم خواهد كرد. به دليل پايين بودن ميزان پاسخ گياهان به كشت بساك، دانشمندان تمام كوشش خود به بهبود محيط‌هاي غذايي كشت و بررسي زادمون‌هاي گياهي و يك مرحله‌اي كردن كشت متمركز ساخته‌اند. كشت بساك اولين بار در غلات و توسط ني‌اي‌زيكي (1967) در برنج انجام شد و تاكنون موفقيتهاي چشمگيري حاصل گرديده است، اما پاسخ اندك به پينه‌زايي و باززايي و فراواني گياهان زال (Albino) از مشكلاتي هستند كه محققان با آن‌ها روبرويند.
كشت رويان :
هنگامي كه دامنه وسيعي از گونه‌هاي گياهي براي كارهاي عملي دورگ‌گيري مورد استفاده قرار مي‌گرفت، كشت رويان به عنوان يك ابزار با ارزشي براي توليد گياهان دورگ در تلاقي‌هاي دور رواج يافت. امروزه براي غلبه بر خواب بذر و عقيمي آن، نجات رويان تلاقي‌هاي دورگ‌هاي ناسازگار و باززايي گياه در داخل لوله آزمايش از روش كشت رويان نارس استفاده مي‌شود. در اين حالت رويان از بذور نارس يا نزديك به مرحله‌ي بلوغ جدا شده و در محيط غذايي مصنوعي كشت مي‌شود. علاوه بر استفاده از اين روش در تلاقي‌هاي بين گونه‌اي و بين جنسي كه معمولاً در مرحله نارسي انجام مي‌شود، از آن مي‌توان براي توليد پينه‌هاي رويان‌زا از رويان نارس و رسيده به منظور تهيه پيش‌دش (پروتوپلاست) يا انتقال ژن و DNA كه در زي فن شناسي مورد توجه فراوان قرار گرفته است، سودبرد. با به‌كارگيري روش نجات رويان دوره زادگيري (به نژادي) از چندين سال به چند ماه كاهش يافته است و تلاقي‌هاي بين گونه‌اي در تعدادي از گياهان مهم اقتصادي مانند پنبه، جو، گوجه‌فرنگي و برنج به طور موفقيت آميزي توسعه يافته است. كشت رويان نارس فقط در محيط‌هاي غذايي ويژه‌اي پاسخ مي‌دهد و عواملي مانند افزايش فشار گذرندگي (اسموزي)، ميزان پتاسيم زياد، بالا بودن نيتروژن به شكل نمك آمونيوم اسيدهاي آلي، اسيد آبسزيك و كاهش فشار اكسيژن، جوانه‌زني زودرس را به تعويق مي‌اندازند. بنابراين علاوه بر رعايت اصول كلي تهيه محيط‌هاي غذايي كشت رويان بايستي به مواردي كه در بالا اشاره شد نيز توجه نمود.
كشت پيش‌دش :
پيش‌دش‌ها ياخته‌هاي عرياني هستند كه ديواره‌ي ياختهاي آن‌ها به روش مكانيكي يا آنزيمي حذف شده باشد. موفقيت در تهيه پيش‌دش‌ها به مرحله‌ي تنكار شناختي منبع گياهي، آنزيم‌هاي مورد استفاده و فشار گذرندگي (اسموزي) محيط غذايي كشت بستگي دارد. سوسپانسيون ياختهاي منبع اصلي كشت پيش‌دش است كه از كشت پينه‌هاي حاصل از ياخته‌هاي جنسي و بدني شامل ريزهاگ، تخمك، رويان نارس و رسيده، ريشه، برگ، ساقه، گره و سپرچه (كلئوپتيل)، غده و دمبرگ در محيط غذاي مايع تهيه شده و سپس در محيط‌هاي غذايي محتوي آنزيم‌هاي سلولاز، پكتيناز، ماسروزيم، اسيدهاي آمينه، بازهاي اسيدنوكلئيك، هورمون‌ها، اسيدهاي آلي، قند، قند الكل‌ها، آب نارگيل ديواره‌ي ياختهاي حذف مي‌گردند و ياخته‌هاي مدوّرفاقد ديواره به دست مي‌آيند. بازدهي و زيستايي پيش‌دش‌ها يعني توانايي توليد مجدد ديواره‌ي ياختهاي و آغاز تقسيم ياخته ، به عوامل گوناگوني نظير روش تهيه پيش‌دش، شرايط تنكار شناختي منابع گياهي (نمونه زيركشت و شرايط رشد)، نوع و غلظت آنزيم‌ها، تركيب محيط غذايي كشت، استحكام غشاي ياختهاي (پلاسمالما) و غيره بستگي دارد. از بعضي اندام‌هاي گياهي به ويژه برگ مي‌توان مستقيماً پيش‌دش‌ها را تهيه كرد. اين ياخته‌ها به علت از دست دادن خاصيت نيمه‌تراوايي خود بايستي در محيط غذايي ويژه‌اي كه فاقد آنزيم‌ها و مواد تجزيه كننده سلولزي و پكتيني است، قرار گيرند و پس از چند روز ديواره‌ي سلولزي را باززايي نمايند و آنگاه در محيط‌هاي غذايي پينه‌زايي و باززايي كشت شده و گياه كاملي را توليد نمايند. باززايي گياهي از پيش‌دش‌ها وسيله‌ي پرارزشي را در اصلاح گياهان زراعي فراهم‌كرده است.
دورگ‌گيري ياخته‌هاي بدني به روش همجوشي پيش‌دش‌ها انجام مي‌شود و كاربرد آن عبارت است از :
1- توليد گياه از دورگ‌هاي بين گونه‌اي با ناسازگاري جنسي.
2- توليد دورگ‌هاي سيتوپلاسمي (سيبريد) و انتقال ژن كلروپلاست از يك والد و ميتوكندري از والد ديگر و دسترسي به تغيير پذيري سيتوپلاسمي شامل نوتركيبي بين اندامك‌هاي ياختهاي به ويژه ميتوكندري.
3- توليد خط‌هاي نرعقيم سيتوپلاسمي.
4- انتقال DNA، اندامك‌هاي ياختهاي نظير كلروپلاست‌ها، كروموزوم‌هاي جدا شده، باكتري‌ها، پلاسميدها و غيره به منظور ايجاد گوناگوني‌هاي زاد شناختي ياخته‌ها، تراريختي پيش‌دش‌ها با استفاده از همجوشي آن‌ها با پلاسميد T i جدا شده فعاليت جالب توجه ديگري براي انتقال ژن است.
از همجوشي پيش‌دش‌ها، دورگ‌هاي هسته‌اي و سيتوپلاسمي حاصل مي‌گردد كه باززايي آن‌ها در مراحل مختلف تقسيم ياخته و در حين پينه‌زايي و تشكيل گياه مي‌تواند رخ دهد. اين دورگ‌هاي بدني ژن‌هاي هسته هر دو والد و سيتوپلاسم هر دو يا فقط يك والد را دارند. بنابراين در گياهان حاصل از دورگ‌هاي بدني تفرق صفات وجود دارد و در نتيجه چنين گياهاني داراي ژن‌هاي هسته‌اي هر دو والد و سيتوپلاسمي يك والد را مي‌توانند همراه داشته باشند.
سوسپانسيون ياختهاي :
كشت‌هاي سوسپانسيون ياختهاي عموماً به منظور تهيه ياخته‌ها يا توده‌هايي از آن به شكل ياخته‌هاي منفرد و جدا از هم، از كشت بافت‌هاو پينه‌ها در محيط‌هاي غذايي مايع و در حال به هم زدن روي تكان دهنده‌هاي مكانيكي در درجه حرارت ثابت و شرايط نوري تعيين شده انجام مي‌شود. ياخته‌هاي پينه در محيط غذايي مايع به دليل تماس نزديك با مواد غذايي و هورمون‌ها داراي ميزان رشد و تكثير بيشتري نسبت به محيط نيمه جامدند و در زمان‌هاي تعيين شده (براي پينه‌هاي برنج هر 7-4 روز) بايستي واكشت شوند تا اولاً محيط غذايي تازه در دسترس ياخته‌ها قرار گيرد و دوماً ياخته‌هاي مرده خارج شوند و سوماً ميزان ياخته‌هاي توليد شده نسبت به مقدار محيط غذايي تنظيم گردد. از سوسپانسيون‌هاي ياختهاي در تهيه پيش‌دش‌ها، باززايي گياهي از طريق اندام زايي يا رويان زايي در ريزازديادي ممكن است استفاده شود. براي بنا نهادن كشت‌هاي سوسپانسيون ياختهاي، پينه‌هاي تمايز نيافته‌اي كه در محيط غذايي القاي پينه نيمه جامد تهيه شده اند را به محيط غذايي مايع انتقال مي‌دهند. كشت‌ها روي تكان دهنده‌هاي چرخشي با سرعت 120-90 دور بر دقيقه در مدت زمان‌هاي معيني در تاريكي يا روشنايي و شدت نور معيني قرار داده مي‌شوند. توده‌هاي ياختهاي ريز يا ياخته‌هاي منفرد معلق در محيط غذايي مايع را به روش صاف كردن از محلول جدا كرده و همراه با كاغذ صافي روي محيط غذايي القاي رويان كشت مي‌دهند تا اين كه پينه‌هاي ثانويه توسعه يابند و گياهان تشكيل شوند.
كشت مرسيتم :
فناوري كشت مريستم عبارت است از كشت مريستم جوانه‌هاي انتهايي و محوري شاخه‌هاي گياهان در محيط‌هاي غذايي محتوي سيتوكنين زياد و توليد گياهان كامل، كه براي بسياري از گياهان زراعي به ويژه آن‌هايي كه به روش تكثير رويشي ازدياد مي‌يابند مورد استفاده قرار مي‌گيرد. اين روش براي حذف ويروس به ويژه در سيب‌زميني كه بيش از 20 نوع ويروس در آن شناسايي شده است كاربرد دارد. مريستم توده‌اي از ياخته‌هاي در حال تقسيم فعال و تمايز نيافته به قطر 1/0 ميلي‌متر و طول 25/0 ميلي‌متر است كه فاقد سازگان آوندي بوده و بنابراين جمعيت ويروسي در آن‌ها پايين است و اغلب اين ويروس ها به گياهان حاصل انتقال نمي‌يابند. گياهچه‌هايي كه در آزمايشگاه تهيه مي‌شوند از لحاظ زادشناختي همانند والد خود هستند و براي تكثير سريع ذخاير بذري سيب‌زميني و عمليات شيمي درماني و گرما درماني كه بازدهي حذف ويروسي را بهبود مي بخشند به عنوان مواد اوليه محسوب مي‌گردند. علاوه بر سيب‌زميني بسياري از گياهاني كه آلودگي به ويروس در آن‌ها مشاهده شده است مانند چغندر قند، توت فرنگي، سيب‌زميني شيرين، گل كلم، موز و گياهان ديگري كه از طريق رويشي تكثير مي‌يابند، اين روش براي حذف ويروس مناسب است. در حال حاضر فنون كشت مريستم در تكثير انبوه، حذف عوامل بيماري‌زا و حفظ ذخاير توارثي مورد استفاده قرار گرفته است.
ريزازديادي:
بسياري از بوته ها، درختچه ها و درختان ناجورتخمند و در زاده هاي بذريشان تفرقه داشته يا بذر توليد نمي كنند و نيز ممكن است بذورحاصل از آن ها داراي دوره‌ي خواب طولاني باشد. بنابراين براي حفظ خلوص زادشناختي اين گياهان از روش تكثير غير جنسي يا رويشي مانند قلمه زني، پيوند زني، خوابانيدن شاخه و كشت بافت استفاده مي شود. توليد مثل غير جنسي به روش كشت بافت را ريزازديادي يا تكثير كلني مي گويند.در حال حاضر فن‌آوري ريزازديادي به طور تجارتي باسود بسيار عالي براي توليد هرساله ميليون ها نهال در سراسر جهان مورد بهره برداري قرار مي گيرد. ريزازديادي به علت توليد نهال‌هاي يكنواخت در مدت زمان هاي نسبتاً كوتاه ودر فضاي تقريباً اندك اهميت اقتصادي فراواني كسب كرده است. فنون كشت بافت براي ازدياد گياهان يكي از مهيج ترين و با اهميت ترين فعاليت هاي اين علم است كه از طريق باززايي اتفاقي (ميا نگره، لبه‌ي برگ، لپه، منطقه‌ي رشد طولي ريشه كه به طور طبيعي مريستم تشكيل نمي شود) و نوپديد (پينه ها و ياخته‌ها) تحقق مي يابد. اين روش در حال حاضر براي بسياري از گياهان زينتي و گلدار مانند اركيده، رز، سبزيجات، سيب زميني و درختان ميوه مانند اوكاليپتوس در حال بهره برداري است. در سال 1993 حدود 501 آزمايشگاه كشت بافت گياهي در سراسر جهان وجود داشته است. در اروپا بيش از 172 شركت ريز ازديادي و 1800 خط توليد كشت بافت مختلف در حال فعاليت بوده است(ريو راديان،1994). مطابق برآورد سال 1990 ، بيش از 300 ميليون نهالي كه هر سال از طريق كشت بافت در جهان توليد مي‌شود، متعلق به كشور هاي نيوزيلند، انگلستان، ايالات متحده آمريكا و ساير كشورهاي اروپايي بود(اگراول، 1996). بنا به گزارش استفان (1993) در سال 1991 بيش از 600 ميليون نهال با روش ريز ازديادي توليد شد. توسعه‌ي صنعتي در كشورهاي پيشرفته شيوه هاي توليد كشاورزي را نيز دگرگون ساخته و حتّي توليد نهال نيز به روش هاي سابق صورت نمي گيرد بلكه با استفاده از كشت بافت به هر تعداد نهال لازم مي توان دست يافت.
انتقال ژن :
در سال‌هاي اخير پيشرفت هاي زيست شناسي ياختهاي و مولكولي در زادشناسي گياهي شوق جديدي را بر انگيخته است. وارد كردن ژن هاي خارجي به ياخته هاي گياهان عالي و بروز نشانويژگي‌هاي كنترل شده توسط آن هدف اساسي تراريخت سازي زادشناختي گياهي براي بسياري از گياهان مهم اقتصادي بوده است. تاكنون انتقال مستقيم ژن نو تركيب خارجي به پيش دش‌هاي گياهي به طور عملي تحقق يافته و با اين روش ياخته هاي تراريخت گندم، جو، ذرت و برنج انجام شده است. تراريختي برنج اولين بار توسط يوشي ميكا در سال 1986 به موفقيت انجاميد. شرط اوليه انتقال ژن خارجي به پيش دش‌ها، امكان باززايي و القاي تشكيل گياه از اين ياخته هاي عريان است. به طوري كه پيش‌دش بسياري از گونه هاي گياهي باززايي نمي شوند و براي تهيه گياهان تراريخت مناسب نيستند. روش استفاده از تفنگ بيوليستيك براي بمباران مستقيم بافت برگ يا پينه با ذرات تنگستن از سال 1987 ابداع گرديده است. اين فن‌آوري نيازمند ياخته‌هايي است كه DNA خارجي بتواند با DNA كروموزومي آن‌ها امتزاج يابد و در تقسيم شركت نمايد. ياخته‌هاي رو پوستي (اپيدرمي) پياز و سپس ذرت اولين بار به عنوان ريزپرتابي‌هايي انتخاب شدند كه DNA خارجي توسط ذرات4 ميكرومتري تنگستن به ياخته هاي آن ها انتقال يافت. روش ديگر انتقال DNA به ياخته هاي گياهي توسط باكتري خاكزي (اگروباكتريوم) انجام مي شود كه بطور مداوم در آزمايشگاه‌هاي زي‌فن‌شناسي مورد استفاده قرار مي گيرد. به طور كلي مراحل مهندسي‌زاد شناختي عبارتند از: واردكردن يا انتقال D NA خارجي به داخل ياخته، ايجاد گروه هاي تراريخت شده، باززايي گياهچه از ياخته هاي تراريختي و تحليل زاد شناختي گياهان حاصل. در حال حاضر به جاي تنگستن از طلا نيز استفاده مي شود.